NCBI中primer-blast使用方法
这个工具整合了目前流行的Primer3软件,再加上NCBI的 Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤,设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验 证。并且,Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression(注:没办法准确的翻译,只好作罢,汗!)。Primer-BLAST有许多改进的功能,这样在选择引物方面比单个的用 Primer3和NCBI BLAST更加准确。
操作方法
(01)Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分:target template(模板区), the primers(引物区), 和specificity check(特异性验证区)。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。
(02)模板(Template) 在“PCR Template”下面的文本框,输入目标模板的序列,FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列,是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物,并且在目标数据库(在specificity check区选择)是唯一的。
(03)引物(Primers) 如果你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库(在specificity check区选择)。根据需要可设置产物的大小,Tm值等。
(04)特异性(Specificity) 在specificity check区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库:RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库
(05)作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种: human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。
特别提示
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