Primer5入門級引物設計攻略

Primer5是分子生物學常用的引物設計軟件，準確率高，操作性強，下面小編就如何利用Primer5進行引物設計分享自己的心得，本篇較簡單，適合初學者。

操作方法

（01）獲取引物模板引物與模板一一對應，設計引物之前先要找到一段匹配的模板。以H9禽流感病毒HA基因爲例，在NCBI上下載一個最新的病毒HA基因作爲本經驗所介紹的引物設計的模板。

（02）新建開啟Primer5（小編的版本爲英文版），依次點擊“file”——“new”——“DNA Sequence”，新建操作介面。

（03）輸入模板基因複製基因模板後，使用鍵盤快速鍵“Ctrl+V”將下載的引物模板粘貼到空白框內，然後選擇“As is”，點擊“OK”。

（04）Search Primer找到介面左上角“Function”——“ Primer”，在新跳出的介面上點擊“Search”，需要設定相應的條件，才能開始搜尋。

（05）條件設定點擊“Search”後，又跳出一個介面，我們從上到下依次設定：“Search For”選擇“PCR Primers”；“Search Type”選擇“Pairs”；“Search Ranges”要根據不同的情況而定，一般來說選擇基因全長，如“1”——“1683”；“PCR Product Size”一般鑑定選擇300-500，測序選擇1200-1600，不能超過基因全長；“Primer Length”一般爲20+(-)2。

（06）點擊兩次“OK”條件設定完畢後，點擊“OK”，跳出新的介面後再點擊“OK”，最後跳出軟件爲你選擇的按照合成率從高到底的全部引物序列。

（07）引物選擇將引物表與左側表格結合起來進行引物的選擇。從小編設計的引物表中看到，最高合成率爲88，其對應的左側表中均出現“Dimer”和“Cross Dimer”，說明此引物不甚理想。最佳的情況爲“Hairpin”、“Dimer”、“False Priming”和“Cross Dimer”都不出現，也就是100合成率。

（08）重新設定條件如何引物不甚理想，那麼就需要重新設定引物的各個條件，尤其是“Search Ranges”的選擇，需要我們再次點擊“Search ”，跳出條件設定介面後重新設定。

（09）選擇理想引物經過多次的不斷更改和設定後，最終選出較爲理想的一對引物，合成率最好在98以上，四種狀況均不出現爲好。