質粒DNA轉化感受態大腸桿菌的方法
學習外源DNA匯入原核生物細胞的方法
操作方法
(01)實驗目的學習外源DNA匯入原核生物細胞的方法
(02)實驗內容熱激處理將外源質粒dna匯入原核細胞。
(03)實驗原理利用CaCl2處理感受態體細胞,然後透過熱休克處理,即置於42℃高溫熱激90秒,熱休克後,需要使受體細胞在不含有抗生素的培養液中生長至少半小時以上,使其表達足夠的蛋白,以便能在含有抗生素的平板上生長菌落。
(04)實驗方法與步驟1、 製備含有Amp抗生素的LB平板。2、 取一個1.5ml離心管,加入100μl感受態細胞懸液,置冰上:加入20ul質粒T+G(提取的質粒DNA稀釋500X),用移液器輕柔混勻。冰上靜置20min。3、 42℃水浴中熱激90秒,然後迅速置冰上3~5min。整個過程不要振盪菌液。4、 加入1ml LB液體培養基(不含抗生素),混勻後37℃振盪培養(180rpm)1小時,使細菌恢復正常生長狀態,並表達質粒編碼的抗生素抗性基因。5、 取100ul菌液,至含有抗生素Amp的LB固體培養基上,塗布均勻。6、 待菌液被培養基吸收後,37℃倒置培養12~16小時,菌落生長良好而又未互相重疊時,取出。7、 計算轉化率8、 統計每一個培養皿中的菌落數。9、 轉化後在含抗生素的平板上長出的菌落即爲轉化子,根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率,公式如下:10、 轉化子總數=菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積/塗板菌液體積;11、 轉化頻率(轉化子數/μg質粒DNA)=轉化子總數/質粒DNA加入量(μg)
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